Fue un compositor posromántico natural de Bohemia —territorio entonces perteneciente al Imperio austríaco—, uno de los primeros compositores checos en lograr el reconocimiento mundial y uno de los grandes compositores de la segunda mitad del siglo XIX. Empleó con frecuencia ritmos y otros aspectos de la música folclórica de Moravia y su Bohemia natal, siguiendo el ejemplo de su predecesor, el nacionalista de la era romántica Bedřich Smetana. Se ha descrito al estilo de Dvořák como «la recreación más completa de un idioma nacional con el de la tradición sinfónica, absorbiendo influencias populares y encontrando formas efectivas de usarlas».

Dvořák mostró sus dotes musicales a una edad temprana, siendo un buen estudiante de violín desde los seis años. Las primeras representaciones públicas de sus obras fueron en Praga en 1872 y, con especial éxito, en 1873, cuando tenía 31 años. Buscando reconocimiento más allá del área de Praga, presentó una partitura de su Primera Sinfonía a un concurso de premios en Alemania, pero no ganó, y el manuscrito no devuelto se perdió hasta que fue redescubierto muchas décadas después. En 1874 hizo una presentación al Premio Estatal de Composición de Austria, incluyendo partituras de dos sinfonías más y otras obras. Aunque no lo sabía, Johannes Brahms fue el miembro principal del jurado y quedó muy impresionado. Le otorgaron el premio en 1874 y nuevamente en 1876 y en 1877, cuando Brahms y el destacado crítico Eduard Hanslick, también miembro del jurado, se presentaron a él. Brahms recomendó a Dvořák a su editor, Fritz Simrock, quien poco después encargó lo que se convirtió en Danzas eslavas, op. 46. Fueron muy elogiadas por el crítico musical de Berlín Louis Ehlert en 1878, la partitura (de la versión original para piano a cuatro manos) tuvo excelentes ventas y lanzó su reputación internacional.

La primera pieza de carácter religioso de Dvořák, su arreglo de Stabat Mater, se estrenó en Praga en 1880. Fue interpretado con gran éxito en Londres en 1883, lo que dio lugar a muchas otras representaciones en el Reino Unido y Estados Unidos. En su carrera, realizó al menos nueve visitas como invitado a Inglaterra, a menudo dirigiendo representaciones de sus propias obras. Su Séptima Sinfonía la escribió para Londres. Al visitar Rusia en marzo de 1890, dirigió conciertos de su propia música en Moscú y San Petersburgo.​ En 1891 lo nombraron profesor en el Conservatorio de Praga. Entre 1890 y 1891, escribió su Trío Dumky, una de sus piezas de música de cámara de mayor éxito.

En 1892, se mudó a Estados Unidos y se convirtió en el director del Conservatorio Nacional de Música de América en Nueva York. La presidenta del Conservatorio Nacional, Jeannette Thurber, le ofreció un salario anual de 15 000 dólares, veinticinco veces lo que le pagaban en el Conservatorio de Praga. Mientras estuvo en Estados Unidos, escribió sus dos obras orquestales más exitosas: la Sinfonía del Nuevo Mundo, que difundió su reputación en todo el mundo,​ y el Concierto para violonchelo. En el verano de 1893, se mudó de Nueva York a Spillville (Iowa), siguiendo el consejo de su secretario, Josef Jan Kovařík. Dvořák había planeado originalmente regresar a Bohemia, pero Spillville estaba compuesto en su mayoría por inmigrantes checos, por lo que sintió menos nostalgia; se refirió a ella como su «Vysoká de verano».​ Allí fue donde escribió su pieza de música de cámara más famosa, su Cuarteto de cuerda en fa mayor, op. 96, que más tarde fue apodado como Cuarteto Americano. Poco después de su estancia en Iowa, extendió su contrato con el Conservatorio Nacional por otros dos años. Sin embargo, la crisis económica de abril de 1893 provocó la pérdida de ingresos del marido de Thurber e influyó directamente en la financiación del Conservatorio Nacional. El déficit en el pago de su salario, junto con el creciente reconocimiento en Europa y un principio de nostalgia, lo llevaron a dejar Estados Unidos y regresar a Bohemia en 1895.

Todas sus nueve óperas, excepto la primera, tienen libretos en checo y estaban destinadas a transmitir el espíritu nacional checo, al igual que algunas de sus obras corales. La más exitosa de las óperas es Rusalka. Entre sus obras más pequeñas, la séptima Humoresca y la canción «Canciones que me enseñó mi madre» también son ampliamente interpretadas y grabadas. Ha sido descrito como «posiblemente el compositor más versátil de su tiempo».

El Festival Internacional de Música de Dvořák de Praga es una importante serie de conciertos que se celebran anualmente para homenajear la vida y la obra del compositor.